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Infektiologie
«Infektiologie: Next Generation Sequencing»

Bei einem vermuteten Ausbruch von multiresistenten Bakterien im Spital müssen rasch effektive Massnahmen durchgeführt werden, um weitere Übertragungen zu verhindern. Die detaillierte Beschreibung der mikrobiologischen und epidemiologischen Zusammenhänge ist dabei von immenser Bedeutung, da die rasche Identifikation der möglichen Quellen und Übertragungsketten weitere meist breite und teure Interventionen und Umgebungsuntersuchungen ver­hindert.

Einleitung

Um etwaige mikrobiologische Zusammenhänge effi­zient und sicher aufklären zu können, werden sogenannte Typisierungsverfahren eingesetzt. Diese basieren meist, ähnlich einem Vaterschaftstest, auf dem Vergleich der genomischen Ähnlichkeit zwischen zwei verdächtigen bakteriellen Isolaten. Je näher verwandt zwei Bakterien in einem Ausbruch sind, desto ähnlicher sind sie zueinander. Sind zwei Bakterien genetisch identisch, spricht man von einem bakteriellen Klon. In der Vergangenheit hat sich eine Vielzahl an verschiedenen Verfahren etabliert, die sich alle in Aufwand und Aussagekraft unterscheiden.

Eine klassische Methode in der Typisierung ist die sogenannte Puls-Feld-Gel-Elektrophorese (PFGE), die eine sehr hohe Auflösung bietet und eine gute Unterscheidung der Isolate erlaubt. Jedoch benötigt die PFGE-­Methode viel Zeit und Erfahrung und lässt sich zwischen verschiedenen diagnostischen Laboratorien nur schwer vergleichen. Dies erschwert die Aufklärung von überregionalen Ausbruchsgeschehen.

Alternative Typisierungsmethoden, wie z.B. «spa-typing» und «multi-locus sequence typing» (MLST), zwei Methoden, die auf der genetischen Sequenz von einem bzw. sieben Marker-Genen des Bakteriums beruhen, bieten eine deutlich bessere Übertragbarkeit der Resultate zwischen Laboratorien. Die Methoden erreichen jedoch oft nicht die benötigte Auflösung, um Ausbrüche und Übertragungswege genau zu beschreiben [1].

Next Generation Sequencing

Aktuell findet eine neuartige Technik der Molekularbiologie rasche Verbreitung, das sogenannte Next­-Generation-Sequencing (NGS; s. Abb. 1). Die entscheidende Neuerung an dieser Technik ist die Möglichkeit, nicht mehr einzelne, kurze Teilstücke des Genoms zu sequenzieren, sondern in einer Messung das gesamte Genom eines Virus oder Bakteriums zu bestimmen. Hierbei werden mehrere Millionen Sequenzierungs­reaktionen parallel durchgeführt. Die Methode erlaubt dadurch, mehrere verschiedene Pathogene gleichzeitig und komplett zu sequenzieren. Die Auflösung von NGS-Daten ist sehr hoch, da das gesamte Genom zum Vergleich zwischen Isolaten verwendet werden kann und nicht mehr, wie in älteren Methoden, einzelne Gene.

Abbildung 1: Ablauf einer NGS-Analyse ausgehend von einem Isolat. Zunächst wird die DNA isoliert, aufgearbeitet und sequenziert. Die Sequenzdaten werden danach bioinformatisch auf Ausbruchsgeschehen analysiert. In diesem Beispiel sind die Isolate A und B genetisch identisch und legen einen ­Ausbruch nahe. Isolat C gehört nicht zu einem Ausbruch mit Isolat A und B.

Ein sehr eindrucksvolles Beispiel für die hohe Auflösung und die Aussagekraft von NGS als Typisierungsmethode ist kürzlich im Journal of Clinical Microbiology erschienen [2]. In dieser Studie wurde NGS verwendet, um die Übertragung von Mycobacterium tuberculosis innerhalb der Schweiz zu untersuchen.

Mit zunehmender Zahl an Flüchtlingen aus Ländern, in denen die Tuberkulose häufiger auftritt als in der Schweiz, erscheint es bei der bisher verwendeten Ty­pisierungsmethode (dem sogenannten MIRU-VNTR) häufig so, als würde sich die Tuberkulose zwischen den Flüchtlingen stark ausbreiten. Stucki und Kollegen konnten jedoch mit Hilfe von NGS zeigen, dass diese vermuteten Übertragungen in etwa 50% der Fälle gar keine waren. Die NGS-Analyse zeigte, dass die grosse Ähnlichkeit der Stämme auf im Herkunftsland vorherrschende M. tuberculosis-Linien beruht. Die Unterschiede in der klassischen Typisierung wurden also deutlich unterschätzt. Dies bedeutet, dass eine Über­tragung der Tuberkulose zwischen Flüchtlingen deutlich seltener vorkommt als zunächst angenommen.

Ein weiterer wichtiger Vorteil von NGS ist die Möglichkeit, Unterschiede zwischen zwei Isolaten quantitativ zu analysieren: Bei nahe verwandten Isolaten können innerhalb eines Ausbruchs kleinste genetische Unterschiede (Punktmutationen) identifiziert werden. Solche Punktmutationen sammeln sich zufällig im Genom von Pathogenen an. Je nach Spezies ist diese spontane Mutationsrate etwas unterschiedlich. Ebenfalls ist die Zeit ein wichtiger Faktor – je länger ein Bakterium Zeit für Mutationen hat, desto mehr Mutationen sammeln sich im Genom an. Sofern die Mutationsrate und der Zeitpunkt der Keimisolation bekannt sind, kann somit abgeschätzt werden, wie lange eine Übertragung zweier Isolate zurückliegt.

Ein Meilenstein auf diesem Gebiet wurde von Harris et al. publiziert [3]: Dabei wurde ein Ausbruch von ­Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)-Isolaten auf einer neonatologischen Station in England untersucht. Anhand der Sequenzen der verschiedenen MRSA-Isolate und der Zahl ihrer Punktmutationen konnte abgeschätzt werden, dass zum Zeitpunkt der Detektion des Ausbruchs, ein Reservoir an verur­sachenden Keimen vorgelegen haben muss. In dem ­Reservoir konnten diese bereits über längere Zeit Punktmutationen ansammeln. In der Tat konnte ein Mitarbeiter als Reservoir identifiziert werden, der mit eben jenen MRSA kolonisiert war.

Diese Methodik beinhaltet für die Spitalhygiene und Experten in der Öffentlichen Gesundheit grosse Vorteile, da nicht nur mit grosser Sicherheit die Entscheidung, ob ein Ausbruch vorgängig ist, getroffen werden kann, sondern auch das Ausmass und die Dynamik des Ausbruchs deutlich besser verstanden werden kann. In der Klinischen Mikrobiologie des Universitätsspitals Basel hat NGS in die mikrobiologische-diagnostische Routine Einzug gehalten.

So konnte vor kurzem mittels NGS ein vermuteter Ausbruch der in Mitteleuropa seltenen kutanen Diphtherie unter Flüchtlingen in der Schweiz und in Süddeutschland untersucht werden [4]. In dieser Untersuchung wurden 20 Flüchtlinge eingeschlossen. Dabei wurde gezeigt, dass mehrere Gruppen an nahe verwandten Isolaten auftraten. Diese gehörten jedoch nicht zu einem kürzlich abgelaufenen Ausbruchsgeschehen, sondern wahrscheinlich zu in Afrika lokal dominierenden Linien bzw. Reservoirs oder zu länger zurückliegenden Ausbrüchen. Dies war von grosser Bedeutung, da dadurch ein Ausbruch in einem Flüchtlingsheim in Europa ausgeschlossen werden konnte.

NGS-Daten können dabei nicht nur für die Typisierung eingesetzt werden, sondern die gesamte genetische ­Information des Isolats kann auf wichtige Virulenz­faktoren durchsucht werden. Diese beeinflussen den Verlauf der Krankheit massgeblich.

Wir konnten in der Analyse der Diphtherie-Erreger das durch einen Bakteriophagen kodierte Diphtherie-­Toxin und ein Gen, das für die Anhaftung am Rachen nötig ist, nachweisen und zeigen, dass die Isolate potentiell die schwerwiegendere Form der Rachendiphtherie auslösen können [4]. Die Kenntnis vorhandener Virulenzfaktoren erlaubt somit eine Risikoabschätzung für den Patienten und dadurch eine gezielte Behandlung und angepasste spitalhygienische Massnahmen. Besonders wegweisend ist auch die Möglichkeit, genetisch die Antibiotika-Resistenzen von Bakterien vorherzusagen. Speziell im Hinblick auf langsam wachsende Erreger wie M. tuberculosis hat NGS grosses diagnos­tisches Potential, da somit schneller eine angepasste Therapie bei resistenten Isolaten möglich ist als bei klassischer kultureller Resistenzprüfung [5]. Der Einsatz von NGS in der ­Diagnostik für Antibiotikaresistenzprüfung und Risikoabschätzung wird daher in ­Zukunft viele Vorteile bringen, ist jedoch vorerst noch auf spezielle Keime beschränkt.

Fazit

NGS revolutioniert die molekulare Typisierung von ­Pathogenen und lässt deshalb viel verlässlichere Aussagen zu. Die Bestimmung der Anzahl an Punktmutationen erlaubt abzuschätzen wie lange eine mögliche Übertragung zurück liegt. Dadurch bekommt die molekulare Epidemiologie die Möglichkeit, Ausbrüche und ihren Hergang besser zu verstehen und zukünftig schneller zu unterbinden.

A.E. wird durch ein Forschungsstipendium des SNSF Ambizione Score unterstützt.

Kopfbild: © Bloopiers | Dreamstime.com;

Korrespondenz:
PD Dr. med. et. phil.
Adrian Egli
Abteilung Klinische ­Mikrobiologie
Universitätsspital Basel
Petersgraben 4
CH-4031 Basel
adrian.egli[at]usb.ch

1 Sabat AJ, Budimir A, Nashev D, Sa-Leao R, van Dijl J, Laurent F, et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro surveillance: bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin. 2013;18:20380.
2 Stucki D, Ballif M, Egger M, Furrer H, Altpeter E, Battegay M, et al. Standard genotyping overestimates transmission of mycobacterium tuberculosis among immigrants in a low-incidence country. J Clin Microbiol. 2016;54:1862–70.
3 Harris SR, Cartwright EJ, Torok ME, Holden MT, Brown NM, Ogilvy-Stuart AL, et al. Whole-genome sequencing for analysis of an outbreak of meticillin-resistant Staphylococcus aureus: a descriptive study. Lancet Infect Dis. 2013;13:130–6.
4 Meinel DM, Kuehl R, Zbinden R, Boskova V, Garzoni C, Fadini D, et al. Outbreak investigation for toxigenic Corynebacterium diphtheriae wound infections in refugees from Northeast Africa and Syria in Switzerland and Germany by whole genome sequencing. Clin Microbiol Infect. 2016. pii: S1198-743X(16)30330-5. doi: 10.1016/j.cmi.2016.08.010.
5 Pankhurst LJ, Del Ojo Elias C, Votintseva AA, Walker TM, Cole K, Davies J, et al. Rapid, comprehensive, and affordable mycobacterial diagnosis with whole-genome sequencing: a prospective study. Lancet Respir Med. 2016;4:49–58.

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